本期胰腺类器官干货，小恒继续为大家介绍胰腺腺泡类器官（PALO）的建立过程及鉴定方法。

1. PALO建立方法

通常情况下，类器官的细胞来源主要是组织中提取的原代细胞、多能干细胞（PSC）或胚胎干细胞（ESC）。而目前大多数文章报道的PALO则主要来源于PSC/ESC；组织来源的原代腺泡细胞建立类器官仍存在一定技术局限性，主要表现为原代腺泡细胞难以在体外长期培养，难以维持腺泡细胞表型，易发生自发性腺泡-导管转化（ADM），进而限制类器官的建立及长期实验的开展，因此原代腺泡细胞来源的PALO仍需更多研究优化或开发新的、有效的培养方法[1]。下面整理hiPSC来源的PALO，供大家参考。

hiPSC或hESC诱导为PALO的前期分化过程与PDLO一致，即先将hiPSC或hESC定向分化为胰腺祖细胞（PPs），接着用特定培养体系诱导PPs往腺泡细胞分化，并抑制腺泡向导管化生。具体建立过程如下[2，3]：

（1）前期准备

hPSC接种到hESC专用Matrigel包被的培养板中，使用mTeSR1或mTeSR Plus培养基进行单细胞培养。

分化前，hPSC需培养至少1周，期间完成2次传代，传代时使用TrypLE Express或TrypLE Select进行消化。确保细胞状态良好、无分化迹象。

（2）分化阶段1：hPSC向PPs分化

①细胞接种（分化前1-2天）

将GFR Matrigel以1:18的比例稀释于DMEM/F12中，预包被24孔板，随后接种hPSC，使用含Y-27632的mTeSR1培养基，培养24-48 h，使细胞密度达到75-95%。

② D0-D1（中内胚层分化）

在D0换液一次。即去除mTeSR1，用PBS洗涤细胞后，kaiyun sports加入含100 ng/mL Activin A、2 μM CHIR-99021的BE1a培养基。

③ D1-D3（定型内胚层分化）

更换为含100 ng/mL Activin A、5 ng/mL FGF2的BE1a培养基，D1、D2各换液1次。

D3可通过流式做质检：CXCR4+/KIT+或SOX17+/GATA6+双阳性率≥95%。

④ D3-D6（肠管内胚层分化）

更换为含50 ng/mL FGF10、0.75 μM Dorsomorphin、3 ng/mL Wnt3a的BE1b培养基，D3-D5每日换液1次。

⑤ D6-D9（胰腺内胚层分化）

更换为含50 ng/mL FGF10、200 nM LDN-193189、0.25 μM SANT-1、2 μM视黄酸、16 mM葡萄糖的BE3培养基，D6-D8每日换液1次。

D9流式检测：PDX1+细胞率≥90%。

⑥ D9-D13（PPs分化）

更换为含100 ng/mL EGF、200 nM LDN-193189、10 mM烟酰胺、330 nM Indolactam V、16 mM葡萄糖的BE3培养基，D9-D12每日换液1次。

D13流式检测：PDX1+/NKX6-1+双阳性率≥60%，威斯人app未达标则进行GP2+分选纯化。（GP2是PPs的表面标志物）

（2）分化阶段2：PPs向PALO分化

诱导PPs向腺泡分化的基础培养基主要成分包括：DMEM培养基，1%双抗，1% B27，10 ng/ml FGF1，50 μg/ml抗坏血酸，1 μM A83-01，10 ng/ml WNT1。后续不同分化时段则在此基础培养基上进行调整，每4天换液一次，且所有培养基中均补充5% Matrigel。

① PPs细胞接种

PPs以5×104/mL的密度重悬于含5% Matrigel的分化培养基中，随后接种于预先用100% Matrigel包被的培养板中。

② D13-D17

基础培养基 + 10 μM Y27632 + 3 μM SKL2001 + 15 ng/ml WNT1 + 50 nM地塞米松 + 5 ng/ml FGF2 + 1 ng/ml EGF + 0.3 μM CHIR99021 + 5 ng/ml FGF10 + 0.1 μM HPI-1 + 50 nM XMU-MP-1

③ D17-D21

基础培养基 + 3 μM SKL2001 + 200 nM地塞米松 + 0.1 μM HPI-1 + 0.1 μM LDN193189 + 5 nM CD3254 + 50 nM XMU-MP-1

④ D21-D25

基础培养基 + 3 μM SKL2001 + 200 nM地塞米松 + 0.1 μM LDN193189 + 1 μM DBZ

⑤ D25起

基础培养基 + 0.3 μM SKL2001 + 25 nM地塞米松 + 0.1 μM DBZ

PALO开始逐渐形成，4天后（即D29）类器官基本形成。

2. PALO鉴定

（1）形态特征

相差显微镜下观察PALO形态，呈直径约为20-105 μm圆球形，体积较小。通过透射电镜（TEM）观察，可见其结构致密，管腔较小，且细胞顶端分布着许多分泌囊泡，与胎儿胰腺中观察到的酶原颗粒前体相似[1]。

图1 PALO形态结构观察[2]

（2）分子标志物表达

PALO可检测到腺泡标志物PTF1A、CTRC、CPA1、AMY表达上调，导管标志物SOX9、HNF1B、CAⅡ不表达或表达量极低，而PDX1表达随分化进程而逐渐降低。

图2 PALO标志物表达情况[2，3]

（3）功能验证

①酶活性检测：PALO的淀粉酶（AMY）和脂肪酶活性显著高于PDLO，碳酸酐酶（CA）活性则低于PDLO。

② Forskolin刺激：Forskolin可以CFTR依赖的方式诱导管腔扩张，而PALO对Forskolin的处理没有反应。

图3 PALO相关功能检测[2]

上述便是根据文献整理关于PALO建立方法及鉴定的内容，更多细节内容可进一步查阅文献。下期我们将介绍胰腺内分泌腺类器官，欢迎持续关注小恒学术~

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参考文献

[1] Paoli C， Carrer A. Organotypic Culture of Acinar Cells for the Study of Pancreatic Cancer Initiation. Cancers (Basel). 2020 Sep 12;12(9):2606. doi: 10.3390/cancers12092606.

[2] Huang L， Desai R， Conrad DN， Leite NC， Akshinthala D， Lim CM， Gonzalez R， Muthuswamy LB， Gartner Z， Muthuswamy SK. Commitment and oncogene-induced plasticity of human stem cell-derived pancreatic acinar and ductal organoids. Cell Stem Cell. 2021 Jun 3;28(6):1090-1104.e6. doi: 10.1016/j.stem.2021.03.022.

[3] Darrigrand JF， Isaacson A， Spagnoli FM. Generation of human iPSC-derived pancreatic organoids to study pancreas development and disease. F1000Res. 2025 Jun 10;14:575. doi: 10.12688/f1000research.162496.1.